《超級馬力歐64 DS》遊戲是以N64的經典3D動作遊戲為基礎所製作，不同於N64版中玩家僅能操作馬力歐，《超級馬力歐64 DS》遊戲中將有馬力歐、路易基、瓦裏奧與耀西這四個角色可供玩家選擇（初期只能使用耀西，其他角色需解救）。除了角色增多之外，遊戲的內容也大幅的增加，新增了許多關卡，能源之星的數目也增加到150顆。遊戲利用NDS的無線網絡功能來提供各種多人遊玩模式，而且通過Download Play,多人模式只需要一個遊戲卡帶就可以使多人一同遊玩。